Heterogenitas serat otot rangka manusa saluareun ranté beurat miosin

Hatur nuhun parantos nganjang ka nature.com. Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS anu terbatas. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun nganggo versi browser pangénggalna (atanapi mareuman modeu kompatibilitas dina Internet Explorer). Salaku tambahan, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, situs ieu bakal bébas tina gaya sareng JavaScript.
Otot rangka nyaéta jaringan hétérogén anu utamina diwangun ku miofibril, anu dina manusa biasana digolongkeun kana tilu jinis: hiji "lambat" (tipe 1) sareng dua "gancang" (tipe 2A sareng 2X). Nanging, hétérogénitas antara sareng dina jinis miofibril tradisional masih kurang kahartos. Kami nerapkeun pendekatan transkriptomik sareng protéomik kana 1050 sareng 1038 miofibril individu tina vastus lateralis manusa. Panilitian protéomik kalebet lalaki, sareng panilitian transkriptomik kalebet 10 lalaki sareng 2 awéwé. Salian ti isoform ranté beurat miosin, kami ngaidentipikasi protéin métabolik, protéin ribosom, sareng protéin gabungan sélular salaku sumber variabilitas intermiofibril multidiménsi. Salajengna, sanaos idéntifikasi gugusan serat laun sareng gancang, data kami nunjukkeun yén serat tipe 2X sacara fenotip teu tiasa dibédakeun tina serat kedutan gancang anu sanés. Salajengna, klasifikasi dumasar ranté beurat miosin henteu cekap pikeun ngajelaskeun fenotipe miofibril dina miopati nemalin. Sacara umum, data kami nunjukkeun heterogenitas miofiber multidiménsi, kalayan sumber variasi anu ngaleuwihan isoform ranté beurat miosin.
Héterogenitas sélular mangrupikeun ciri anu aya dina sadaya sistem biologis, anu ngamungkinkeun sél pikeun ngahususkeun pikeun minuhan kabutuhan jaringan sareng sél anu béda.1 Pamadegan tradisional ngeunaan héterogenitas serat otot rangka nyaéta neuron motor ngahartikeun jinis serat dina unit motor, sareng jinis serat (nyaéta, tipe 1, tipe 2A, sareng tipe 2X dina manusa) ditangtukeun ku karakteristik isoform ranté beurat miosin (MYH).2 Ieu mimitina dumasar kana ketidakstabilan pH ATPase na,3,4 sareng engkéna kana éksprési molekuler MYH na.5 Nanging, kalayan idéntifikasi sareng panampi salajengna tina serat "campuran" anu ngébréhkeun sababaraha MYH dina babandingan anu béda-béda, serat otot rangka beuki katingali salaku kontinum tinimbang salaku jinis serat anu béda.6 Sanaos kitu, widang ieu masih ngandelkeun pisan kana MYH salaku klasifikasi primér pikeun klasifikasi miofiber, pandangan anu kamungkinan dipangaruhan ku watesan sareng bias anu signifikan tina studi rodénsia awal anu profil éksprési MYH sareng rentang jinis serat béda ti anu aya dina manusa.2 Kaayaan ieu langkung rumit ku kanyataan yén otot rangka manusa anu béda-béda nunjukkeun rupa-rupa jinis serat.7 Vastus lateralis nyaéta otot campuran kalayan profil éksprési MYH sedeng (sareng ku kituna ngawakilan).7 Salajengna, gampangna nyandak sampel ngajantenkeun otot anu paling seueur ditalungtik dina manusa.
Ku kituna, panalungtikan anu teu bias ngeunaan karagaman serat otot rangka nganggo alat "omics" anu kuat penting tapi ogé nangtang, sabagian kusabab sifat multinukleus serat otot rangka. Nanging, téknologi transcriptomics8,9 sareng proteomics10 parantos ngalaman révolusi dina sensitivitas dina sababaraha taun terakhir kusabab rupa-rupa kamajuan téknologi, anu ngamungkinkeun analisis otot rangka dina résolusi serat tunggal. Hasilna, kamajuan anu signifikan parantos dilakukeun dina ngacirikeun karagaman serat tunggal sareng résponna kana rangsangan atrofi sareng sepuh11,12,13,14,15,16,17,18. Anu penting, kamajuan téknologi ieu gaduh aplikasi klinis, anu ngamungkinkeun pikeun karakterisasi anu langkung rinci sareng tepat ngeunaan disregulasi anu aya hubunganana sareng panyakit. Salaku conto, patofisiologi miopati nemalin, salah sahiji panyakit otot turunan anu paling umum (MIM 605355 sareng MIM 161800), rumit sareng ngabingungkeun.19,20 Ku alatan éta, karakterisasi anu langkung saé ngeunaan disregulasi serat otot rangka tiasa nyababkeun kamajuan anu signifikan dina pamahaman urang ngeunaan panyakit ieu.
Kami ngembangkeun metode pikeun analisis transkriptomik sareng protéomik tina serat otot rangka tunggal anu diisolasi sacara manual tina spésimén biopsi manusa sareng nerapkeunana kana rébuan serat, anu ngamungkinkeun kami pikeun nalungtik hétérogénitas sélular serat otot rangka manusa. Dina padamelan ieu, kami nunjukkeun kakuatan fenotipe transkriptomik sareng protéomik serat otot sareng ngaidentipikasi protéin gabungan métabolik, ribosom, sareng sélular salaku sumber anu signifikan tina variabilitas interfiber. Salajengna, nganggo alur kerja protéomik ieu, kami ngacirikeun relevansi klinis miopati nematoda dina serat otot rangka tunggal, ngungkabkeun parobahan anu terkoordinasi nuju serat non-oksidatif anu henteu gumantung kana jinis serat dumasar kana MYH.
Pikeun nalungtik hétérogénitas serat otot rangka manusa, kami ngembangkeun dua alur kerja pikeun ngamungkinkeun analisis transkriptom sareng protéom tina serat otot rangka tunggal (Gambar 1A sareng Gambar Tambahan 1A). Kami ngembangkeun sareng ngaoptimalkeun sababaraha léngkah metodologis, ti panyimpenan sampel sareng pelestarian integritas RNA sareng protéin dugi ka ngaoptimalkeun throughput pikeun unggal pendekatan. Pikeun analisis transkriptom, ieu kahontal ku cara nyelapkeun barcode molekuler spésifik sampel dina léngkah awal transkripsi tibalik, ngamungkinkeun 96 serat dikumpulkeun pikeun pamrosésan hilir anu efisien. Sekuensing anu langkung jero (± 1 juta bacaan per serat) dibandingkeun sareng pendekatan sél tunggal tradisional langkung ngabeungharan data transkriptom. 21 Pikeun protéomik, kami nganggo gradien kromatografi pondok (21 menit) digabungkeun sareng akuisisi data DIA-PASEF dina spéktrométer massa timsTOF pikeun ngaoptimalkeun jerona protéom bari ngajaga throughput anu luhur. 22,23 Pikeun nalungtik hétérogénitas serat otot rangka anu séhat, urang ngacirikeun transkriptom tina 1.050 serat individu ti 14 donor déwasa anu séhat sareng protéom tina 1.038 serat ti 5 donor déwasa anu séhat (Tabel Tambahan 1). Dina tulisan ieu, sét data ieu disebut transkriptom sareng protéom 1.000 serat, masing-masing. Pendekatan urang ngadeteksi total 27.237 transkrip sareng 2.983 protéin dina analisis transkriptomik sareng protéomik 1.000 serat (Gambar 1A, Sét Data Tambahan 1–2). Saatos nyaring sét data transkriptomik sareng protéomik pikeun >1.000 gén anu dideteksi sareng 50% nilai anu valid per serat, analisis bioinformatika salajengna dilaksanakeun pikeun 925 sareng 974 serat dina transkriptom sareng protéom, masing-masing. Saatos disaring, rata-rata 4257 ± 1557 gén sareng 2015 ± 234 protéin (rata-rata ± SD) dideteksi per serat, kalayan variabilitas antar-individu anu terbatas (Gambar Tambahan 1B–C, Set Data Tambahan 3–4). Nanging, variabilitas dina subjek langkung jelas di sakumna pamilon, kamungkinan kusabab bédana dina hasil RNA/protéin antara serat anu panjangna béda sareng daérah cross-sectional. Pikeun kalolobaan protéin (>2000), koéfisién variasi di handap 20% (Gambar Tambahan 1D). Kadua metode ngamungkinkeun néwak rentang dinamis transkrip sareng protéin anu lega kalayan tanda tangan anu diekspresikan kalayan luhur anu penting pikeun kontraksi otot (contona, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Gambar Tambahan 1E–F). Kaseueuran fitur anu diidentifikasi umum antara set data transkriptomik sareng protéomik (Gambar Tambahan 1G), sareng inténsitas UMI/LFQ rata-rata tina fitur ieu berkorelasi sacara lumayan saé (r = 0,52) (Gambar Tambahan 1H).
Alur kerja transkriptomik sareng protéomik (didamel nganggo BioRender.com). BD Kurva rentang dinamis pikeun MYH7, MYH2, sareng MYH1, sareng ambang batas anu diitung pikeun panempatan jinis serat. E, F Distribusi éksprési MYH di sakuliah serat dina sét data transkriptomik sareng protéomik. G, H Plot Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP) pikeun transkriptomik sareng protéomik anu diwarnaan ku jinis serat dumasar MYH. I, J Plot fitur anu nunjukkeun éksprési MYH7, MYH2, sareng MYH1 dina sét data transkriptomik sareng protéomik.
Mimitina urang netepkeun pikeun nangtukeun jinis serat dumasar MYH ka unggal serat nganggo pendekatan anu dioptimalkeun anu ngamangpaatkeun sensitivitas anu luhur sareng rentang dinamis éksprési MYH dina sét data omics. Panilitian sateuacana parantos nganggo ambang batas anu teu ditangtukeun pikeun ngalabel serat salaku tipe murni 1, tipe 2A, tipe 2X, atanapi campuran dumasar kana persentase éksprési anu tetep tina MYH anu béda11,14,24. Urang nganggo pendekatan anu béda dimana éksprési unggal serat dirangking ku MYH anu urang anggo pikeun ngetik serat: MYH7, MYH2, sareng MYH1, anu saluyu sareng serat tipe 1, tipe 2A, sareng tipe 2X. Teras sacara matematis urang ngitung titik infleksi anu langkung handap tina unggal kurva anu dihasilkeun sareng dianggo salaku ambang batas pikeun nangtukeun serat salaku positip (di luhur ambang batas) atanapi négatip (di handap ambang batas) pikeun unggal MYH (Gambar 1B–D). Data ieu nunjukkeun yén MYH7 (Gambar 1B) sareng MYH2 (Gambar 1C) gaduh profil éksprési on/off anu langkung béda dina tingkat RNA dibandingkeun sareng tingkat protéin. Memang, dina tingkat protéin, saeutik pisan serat anu henteu ngébréhkeun MYH7, sareng teu aya serat anu gaduh éksprési MYH2 100%. Salajengna kami nganggo ambang éksprési anu ditangtukeun pikeun masihan jinis serat dumasar MYH ka sadaya serat dina unggal sét data. Salaku conto, serat MYH7+/MYH2-/MYH1- ditugaskeun ka jinis 1, sedengkeun serat MYH7-/MYH2+/MYH1+ ditugaskeun ka jinis campuran 2A/2X (tingali Tabel Tambahan 2 pikeun katerangan lengkep). Ngahijikeun sadaya serat, kami niténan distribusi jinis serat dumasar MYH anu sami dina tingkat RNA (Gambar 1E) sareng protéin (Gambar 1F), sedengkeun komposisi relatif jinis serat dumasar MYH rupa-rupa di unggal individu, sapertos anu dipiharep (Gambar Tambahan 2A). Kaseueuran serat digolongkeun salaku jinis 1 murni (34–35%) atanapi jinis 2A (36–38%), sanaos sajumlah ageung serat jinis campuran 2A/2X ogé dideteksi (16–19%). Bédana anu mencolok nyaéta serat tipe 2X murni ngan ukur tiasa dideteksi dina tingkat RNA, tapi sanés dina tingkat protéin, nunjukkeun yén éksprési MYH anu gancang sahenteuna sabagian diatur sacara pasca-transkripsi.
Kami ngavalidasi metode pengetikan serat MYH berbasis protéomik nganggo dot blotting berbasis antibodi, sareng duanana metode ngahontal 100% kasapukan dina ngaidentipikasi serat tipe 1 sareng tipe 2A murni (tingali Gambar Tambahan 2B). Nanging, pendekatan berbasis protéomik langkung sénsitip, langkung efisien dina ngaidentipikasi serat campuran, sareng ngitung proporsi unggal gén MYH dina unggal serat. Data ieu nunjukkeun efektivitas ngagunakeun pendekatan berbasis omics anu obyektif sareng sénsitip pisan pikeun ngacirikeun jinis serat otot rangka.
Teras kami nganggo gabungan inpormasi anu disayogikeun ku transkriptomik sareng protéomik pikeun sacara obyektif ngaklasifikasikeun miofiber dumasar kana transkriptom atanapi protéom lengkepna. Ngagunakeun metode pendekatan sareng proyéksi manifold seragam (UMAP) pikeun ngirangan diménsi kana genep komponén utama (Gambar Tambahan 3A–B), kami tiasa ngabayangkeun variabilitas miofiber dina transkriptom (Gambar 1G) sareng protéom (Gambar 1H). Anu penting, miofiber henteu dikelompokkeun ku pamilon (Gambar Tambahan 3C–D) atanapi dinten uji coba (Gambar Tambahan 3E) boh dina kumpulan data transkriptomik atanapi protéomik, nunjukkeun yén variabilitas dina subjek dina serat otot rangka langkung luhur tibatan variabilitas antara subjek. Dina plot UMAP, dua klaster anu béda anu ngawakilan miofiber "gancang" sareng "laun" muncul (Gambar 1G–H). Miofiber MYH7+ (laun) dikelompokkeun dina kutub positif UMAP1, sedengkeun miofiber MYH2+ sareng MYH1+ (gancang) dikelompokkeun dina kutub negatif UMAP1 (Gambar 1I–J). Nanging, teu aya bédana anu dilakukeun antara jinis serat kedutan gancang (nyaéta, tipe 2A, tipe 2X, atanapi campuran 2A/2X) dumasar kana éksprési MYH, nunjukkeun yén MYH1 (Gambar 1I–J) atanapi spidol miofiber 2X klasik sanésna sapertos ACTN3 atanapi MYLK2 (Gambar Tambahan 4A–B) henteu ngabédakeun antara jinis miofiber anu béda nalika mertimbangkeun sakabéh transkriptom atanapi protéom. Leuwih ti éta, dibandingkeun sareng MYH2 sareng MYH7, saeutik transkrip atanapi protéin anu berkorelasi positif sareng MYH1 (Gambar Tambahan 4C–H), nunjukkeun yén kaayaan MYH1 henteu sapinuhna ngagambarkeun transkriptom/protéom miofiber. Kacindekan anu sami kahontal nalika meunteun éksprési campuran tina tilu isoform MYH dina tingkat UMAP (Gambar Tambahan 4I–J). Janten, sanaos serat 2X tiasa diidentipikasi dina tingkat transkrip dumasar kana kuantifikasi MYH nyalira, serat MYH1+ henteu tiasa dibédakeun tina serat gancang anu sanés nalika mertimbangkeun sadayana transkriptom atanapi protéom.
Salaku éksplorasi awal ngeunaan hétérogénitas serat laun saluareun MYH, kami meunteun opat protéin spésifik tipe serat laun anu tos ditetepkeun: TPM3, TNNT1, MYL3, sareng ATP2A22. Subtipe serat laun nunjukkeun korélasi Pearson anu luhur, sanaos henteu sampurna, sareng MYH7 dina transkriptomik (Gambar Tambahan 5A) sareng protéomik (Gambar Tambahan 5B). Sakitar 25% sareng 33% serat laun henteu diklasifikasikeun salaku serat laun murni ku sadaya subtipe gén/protéin dina transkriptomik (Gambar Tambahan 5C) sareng protéomik (Gambar Tambahan 5D), masing-masing. Ku alatan éta, klasifikasi serat laun dumasar kana sababaraha subtipe gén/protéin ngenalkeun kompleksitas tambahan, bahkan pikeun protéin anu dipikanyaho spésifik tipe serat. Ieu nunjukkeun yén klasifikasi serat dumasar kana isoform tina hiji kulawarga gén/protéin tiasa henteu ngagambarkeun sacara nyukupan hétérogénitas serat otot rangka anu saleresna.
Pikeun leuwih ngajalajah variabilitas fenotipik serat otot rangka manusa dina skala sakabéh modél omics, kami ngalaksanakeun réduksi diménsionalitas data anu teu bias nganggo analisis komponén utama (PCA) (Gambar 2A). Sarupa sareng plot UMAP, boh pamilon atanapi dinten tés henteu mangaruhan klaster serat dina tingkat PCA (Gambar Tambahan 6A–C). Dina dua sét data, jinis serat dumasar MYH dijelaskeun ku PC2, anu nunjukkeun gugusan serat tipe 1 anu laun-laun berkedut sareng gugusan kadua anu ngandung tipe 2A anu gancang berkedut, tipe 2X, sareng serat 2A/2X campuran (Gambar 2A). Dina dua sét data, dua gugusan ieu dihubungkeun ku sajumlah alit serat tipe 1/2A campuran. Sapertos anu dipiharep, analisis overrepresentasi tina panggerak PC utama mastikeun yén PC2 didorong ku tanda tangan kontraktil sareng métabolik (Gambar 2B sareng Gambar Tambahan 6D–E, Sét Data Tambahan 5–6). Sacara umum, jinis serat dumasar MYH kapanggih cekap pikeun ngajelaskeun variasi kontinyu sapanjang PC2, iwal ti anu disebut serat 2X anu disebarkeun di sakuliah transkriptom dina klaster gancang.
A. Plot analisis komponén utama (PCA) tina sét data transkriptom sareng protéom diwarnaan numutkeun jinis serat dumasar kana MYH. B. Analisis pangayaan panggerak transkrip sareng protéin dina PC2 sareng PC1. Analisis statistik dilakukeun nganggo pakét clusterProfiler sareng nilai-p anu disaluyukeun Benjamini-Hochberg. C, D. Plot PCA diwarnaan numutkeun istilah ontologi gén adhesi intersélular (GO) dina istilah transkriptom sareng costamere GO dina protéom. Panah ngagambarkeun panggerak transkrip sareng protéin sareng arahna. E, F. Plot fitur pendekatan sareng proyéksi manifold seragam (UMAP) tina fitur anu relevan sacara klinis anu nunjukkeun gradien éksprési anu henteu gumantung kana jinis serat laun/gancang. G, H. Korélasi antara panggerak PC2 sareng PC1 dina transkriptom sareng protéom.
Teu disangka-sangka, tipe miofiber dumasar MYH ngan ukur ngajelaskeun tingkat variabilitas kadua pangluhurna (PC2), nunjukkeun yén faktor biologis sanés anu teu aya hubunganana sareng tipe miofiber dumasar MYH (PC1) maénkeun peran penting dina ngatur heterogenitas serat otot rangka. Analisis overrepresentasi tina panggerak utama dina PC1 ngungkabkeun yén variabilitas dina PC1 utamina ditangtukeun ku adhesi sél-sél sareng eusi ribosom dina transkriptom, sareng kostamer sareng protéin ribosom dina protéom (Gambar 2B sareng Gambar Tambahan 6D–E, Set Data Tambahan 7). Dina otot rangka, kostamer nyambungkeun cakram-Z kana sarkolema sareng kalibet dina transmisi gaya sareng pensinyalan. 25 Plot PCA anu dianotasi nganggo fitur adhesi sél-sél (transkriptom, Gambar 2C) sareng kostamer (protéom, Gambar 2D) ngungkabkeun pergeseran kénca anu kuat dina PC1, nunjukkeun yén fitur-fitur ieu diperkaya dina serat-serat tertentu.
Pamariksaan anu langkung lengkep ngeunaan klaster miofiber dina tingkat UMAP ngungkabkeun yén kaseueuran fitur nunjukkeun gradien éksprési dumasar kana jinis miofiber anu henteu gumantung kana MYH tinimbang subkluster miofiber anu spésifik. Kontinuitas ieu dititénan pikeun sababaraha gén anu aya hubunganana sareng kaayaan patologis (Gambar 2E), sapertos CHCHD10 (panyakit neuromuskular), SLIT3 (atrofi otot), CTDNEP1 (panyakit otot). Kontinuitas ieu ogé dititénan di sakumna protéom, kalebet protéin anu aya hubunganana sareng gangguan neurologis (UGDH), sinyal insulin (PHIP), sareng transkripsi (HIST1H2AB) (Gambar 2F). Sacara koléktif, data ieu nunjukkeun kontinuitas dina heterogenitas kedutan laun/gancang anu henteu gumantung kana jinis serat di sakumna miofiber anu béda.
Anu pikaresepeun, gén panggerak dina PC2 nunjukkeun korélasi transkriptom-protéom anu saé (r = 0,663) (Gambar 2G), nunjukkeun yén jinis serat kedutan laun sareng gancang, sareng khususna sipat kontraktil sareng métabolik serat otot rangka, diatur sacara transkripsi. Nanging, gén panggerak dina PC1 henteu nunjukkeun korélasi transkriptom-protéom (r = -0,027) (Gambar 2H), nunjukkeun yén variasi anu teu aya hubunganana sareng jinis serat kedutan laun/gancang seueur diatur sacara pasca-transkripsi. Kusabab variasi dina PC1 utamina dijelaskeun ku istilah ontologi gén ribosom, sareng kumargi ribosom maénkeun peran penting sareng khusus dina sél ku cara aktip milu sareng mangaruhan tarjamahan protéin,31 salajengna kami ngamimitian nalungtik hétérogénitas ribosom anu teu kaduga ieu.
Mimitina urang ngawarnaan plot analisis komponén utama protéomik numutkeun kaayaan protéin dina istilah GOCC "ribosom sitoplasma" (Gambar 3A). Sanaos istilah ieu diperkaya dina sisi positip PC1, anu ngahasilkeun gradién leutik, protéin ribosom ngadorong partisi dina dua arah PC1 (Gambar 3A). Protéin ribosom anu diperkaya dina sisi négatip PC1 kalebet RPL18, RPS18, sareng RPS13 (Gambar 3B), sedengkeun RPL31, RPL35, sareng RPL38 (Gambar 3C) mangrupikeun pendorong utama dina sisi positip PC1. Anu pikaresepeun, RPL38 sareng RPS13 diekspresikan pisan dina otot rangka dibandingkeun sareng jaringan sanés (Gambar Tambahan 7A). Tanda tangan ribosom anu khas ieu dina PC1 henteu katingali dina transkriptom (Gambar Tambahan 7B), nunjukkeun régulasi pasca-transkripsi.
A. Plot analisis komponén utama (PCA) diwarnaan dumasar kana istilah ontologi gén ribosom sitoplasma (GO) di sakuliah protéom. Panah nunjukkeun arah variasi anu dimediasi protéin dina plot PCA. Panjang garis pakait sareng skor komponén utama pikeun protéin anu dipasihkeun. B, C. Plot fitur PCA pikeun RPS13 sareng RPL38. D. Analisis klaster hirarkis anu teu diawasi tina protéin ribosom sitoplasma. E. Modél struktural ribosom 80S (PDB: 4V6X) anu nyorot protéin ribosom kalayan kaayaan anu béda dina serat otot rangka. F. Protéin ribosom kalayan stoikiometri anu béda dilokalisasi caket saluran kaluar mRNA.
Konsép hétérogénitas sareng spésialisasi ribosom parantos diusulkeun sateuacanna, dimana ayana subpopulasi ribosom anu béda (hétérogénitas ribosom) tiasa langsung mangaruhan tarjamahan protéin dina jaringan sareng sél anu béda32 ngaliwatan tarjamahan selektif tina kumpulan transkrip mRNA spésifik34 (spésialisasi ribosom). Pikeun ngaidentipikasi subpopulasi protéin ribosom anu diekspresikeun sacara ko-dina serat otot rangka, kami ngalaksanakeun analisis klaster hirarkis anu teu diawasi tina protéin ribosom dina protéom (Gambar 3D, Set Data Tambahan 8). Sapertos anu dipiharep, protéin ribosom henteu ngagugus dumasar kana jinis serat dumasar kana MYH. Nanging, kami ngaidentipikasi tilu klaster protéin ribosom anu béda; klaster kahiji (kluster_ribosomal_1) dikorégulasi sareng RPL38 sareng ku kituna ngagaduhan éksprési anu ningkat dina serat kalayan profil PC1 positip. Klaster kadua (kluster_ribosomal_2) dikorégulasi sareng RPS13 sareng ningkat dina serat kalayan profil PC1 négatip. Gugus katilu (gugus_ribosomal_3) henteu nunjukkeun éksprési diferensial anu terkoordinasi dina serat otot rangka sareng tiasa dianggap protéin ribosom otot rangka "inti". Duanana gugus ribosom 1 sareng 2 ngandung protéin ribosom anu sateuacanna parantos dipidangkeun pikeun ngatur tarjamahan alternatif (contona, RPL10A, RPL38, RPS19, sareng RPS25) sareng sacara fungsional mangaruhan kamekaran (contona, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Saluyu sareng hasil PCA, répréséntasi hétérogén anu dititénan tina protéin ribosom ieu di sakuliah serat ogé nunjukkeun kontinuitas (Gambar Tambahan 7C).
Pikeun ngabayangkeun lokasi protéin ribosom hétérogén dina ribosom, urang nganggo modél struktural ribosom 80S manusa (Protein Data Bank: 4V6X) (Gambar 3E). Saatos ngasingkeun protéin ribosom anu kagolong kana klaster ribosom anu béda, lokasi na henteu raket, nunjukkeun yén pendekatan urang gagal nyayogikeun pangayaan pikeun daérah/fraksi ribosom anu tangtu. Nanging, anu pikaresepeun nyaéta proporsi protéin subunit ageung dina klaster 2 langkung handap tibatan dina klaster 1 sareng 3 (Gambar Tambahan 7D). Urang niténan yén protéin kalayan stoikiometri anu robih dina serat otot rangka utamina dilokalisasi kana permukaan ribosom (Gambar 3E), saluyu sareng kamampuanna pikeun berinteraksi sareng unsur situs éntri ribosom internal (IRES) dina populasi mRNA anu béda, ku kituna koordinasi tarjamahan selektif. 40, 41 Salajengna, seueur protéin kalayan stoikiometri anu robih dina serat otot rangka ayana di caket daérah fungsional sapertos torowongan kaluar mRNA (Gambar 3F), anu sacara selektif ngatur elongasi translasi sareng eureun péptida khusus. 42 Singkatna, data kami nunjukkeun yén stoikiometri protéin ribosom otot rangka nunjukkeun hétérogénitas, anu ngahasilkeun bédana antara serat otot rangka.
Salajengna, urang mimitian pikeun ngaidentipikasi tanda serat anu gancang sareng laun-twitch sareng nalungtik mékanisme pangaturan transkripsi na. Ngabandingkeun klaster serat anu gancang sareng laun-twitch anu ditetepkeun ku UMAP dina dua sét data (Gambar 1G-H sareng 4A-B), analisis transkriptomik sareng protéomik ngaidentipikasi 1366 sareng 804 fitur anu béda-béda, masing-masing (Gambar 4A-B, Sét Data Tambahan 9-12). Kami niténan bédana anu dipiharep dina tanda tangan anu aya hubunganana sareng sarkomer (contona, tropomiosin sareng troponin), gandéngan eksitasi-kontraksi (isoform SERCA), sareng métabolisme énergi (contona, ALDOA sareng CKB). Leuwih ti éta, transkrip sareng protéin anu ngatur ubiquitinasi protéin diekspresikan sacara béda dina serat anu gancang sareng laun-twitch (contona, USP54, SH3RF2, USP28, sareng USP48) (Gambar 4A-B). Leuwih ti éta, gén protéin mikroba RP11-451G4.2 (DWORF), anu sateuacanna parantos dipidangkeun diekspresikeun sacara béda dina sadaya jinis serat otot domba43 sareng ningkatkeun aktivitas SERCA dina otot jantung44, sacara signifikan ningkat dina serat otot rangka laun (Gambar 4A). Nya kitu, dina tingkat serat individu, béda anu signifikan dititénan dina tanda tangan anu dipikanyaho sapertos isoform laktat dehidrogenase anu aya hubunganana sareng métabolisme (LDHA sareng LDHB, Gambar 4C sareng Gambar Tambahan 8A)45,46 ogé tanda tangan khusus jinis serat anu sateuacanna teu dipikanyaho (sapertos IRX3, USP54, USP28, sareng DPYSL3) (Gambar 4C). Aya tumpang tindih anu signifikan tina fitur anu diekspresikeun sacara béda antara sét data transkriptomik sareng protéomik (Gambar Tambahan 8B), ogé korélasi parobahan lipatan anu didorong utamina ku éksprési diferensial anu langkung jelas tina fitur sarkomer (Gambar Tambahan 8C). Anu penting, sababaraha tanda tangan (contona USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) nunjukkeun pangaturan pasca-transkripsi anu kuat ngan ukur dina tingkat protéomik sareng gaduh profil éksprési spésifik tipe serat kedutan laun/gancang (Gambar Tambahan 8C).
Plot gunungapi A sareng B anu ngabandingkeun gugusan anu laun sareng gancang anu diidentipikasi ku plot pendekatan sareng proyéksi manifold seragam (UMAP) dina Gambar 1G–H. Titik-titik warna ngagambarkeun transkrip atanapi protéin anu béda sacara signifikan dina FDR <0,05, sareng titik-titik anu langkung poék ngagambarkeun transkrip atanapi protéin anu béda sacara signifikan dina parobahan log > 1. Analisis statistik dua arah dilakukeun nganggo uji DESeq2 Wald kalayan nilai p anu disaluyukeun Benjamini-Hochberg (transkriptomik) atanapi metode modél linier Limma kalayan analisis Bayesian empiris dituturkeun ku panyesuaian Benjamini-Hochberg pikeun sababaraha babandingan (protéomik). C Plot tanda tangan tina gén atanapi protéin anu diekspresikeun sacara béda antara serat laun sareng gancang. D Analisis pangayaan transkrip sareng protéin anu diekspresikeun sacara béda sacara signifikan. Nilai anu tumpang tindih diperkaya dina dua sét data, nilai transkriptom diperkaya ngan ukur dina transkriptom, sareng nilai protéom diperkaya ngan ukur dina protéom. Analisis statistik dilakukeun nganggo pakét clusterProfiler kalayan nilai-p anu disaluyukeun Benjamini-Hochberg. E. Faktor transkripsi spésifik tipe serat anu diidentipikasi ku SCENIC dumasar kana skor spésifisitas régulator anu diturunkeun tina SCENIC sareng éksprési mRNA diferensial antara tipe serat. F. Profil faktor transkripsi anu dipilih anu diéksprésikeun sacara béda antara serat laun sareng gancang.
Teras kami ngalaksanakeun analisis overrepresentasi tina gén sareng protéin anu diwakilan sacara béda (Gambar 4D, Set Data Tambahan 13). Pangayaan jalur pikeun fitur anu béda antara dua sét data ngungkabkeun béda anu dipiharep, sapertos prosés oksidasi β asam lemak sareng métabolisme keton (serat laun), miofilamen/kontraksi otot (serat gancang sareng laun, masing-masing), sareng prosés katabolik karbohidrat (serat gancang). Aktivitas protéin fosfatase serin/treonin ogé ningkat dina serat gancang, didorong ku fitur sapertos subunit fosfatase pangaturan sareng katalitik (PPP3CB, PPP1R3D, sareng PPP1R3A), anu dipikanyaho ngatur métabolisme glikogén (47) (Gambar Tambahan 8D–E). Jalur séjén anu beunghar ku serat gancang kalebet awak pamrosésan (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) dina protéom (Gambar Tambahan 8F), anu poténsial kalibet dina régulasi pasca-transkripsi (48), sareng aktivitas faktor transkripsi (SREBF1, RXRG, RORA) dina transkriptom (Gambar Tambahan 8G). Serat laun beunghar ku aktivitas oksidoreduktase (BDH1, DCXR, TXN2) (Gambar Tambahan 8H), pangiket amida (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Gambar Tambahan 8I), matriks ékstrasélulér (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Gambar Tambahan 8J), sareng aktivitas reséptor-ligan (FNDC5, SPX, NENF) (Gambar Tambahan 8K).
Pikeun kéngingkeun wawasan langkung seueur ngeunaan pangaturan transkripsi anu aya dina dasar karakteristik jinis serat otot laun/gancang, kami ngalaksanakeun analisis pangayaan faktor transkripsi nganggo SCENIC49 (Set Data Tambahan 14). Seueur faktor transkripsi anu diperkaya sacara signifikan antara serat otot gancang sareng laun (Gambar 4E). Ieu kalebet faktor transkripsi sapertos MAFA, anu sateuacanna parantos dihubungkeun sareng kamekaran serat otot gancang,50 ogé sababaraha faktor transkripsi anu sateuacanna henteu aya hubunganana sareng program gén spésifik jinis serat otot. Di antara ieu, PITX1, EGR1, sareng MYF6 mangrupikeun faktor transkripsi anu paling diperkaya dina serat otot gancang (Gambar 4E). Sabalikna, ZSCAN30 sareng EPAS1 (ogé katelah HIF2A) mangrupikeun faktor transkripsi anu paling diperkaya dina serat otot laun (Gambar 4E). Saluyu sareng ieu, MAFA diekspresikan dina tingkat anu langkung luhur di daérah UMAP anu saluyu sareng serat otot gancang, sedengkeun EPAS1 ngagaduhan pola éksprési anu sabalikna (Gambar 4F).
Salian ti gén pangkode protéin anu dipikanyaho, aya seueur biotipe RNA non-coding anu tiasa kalibet dina pangaturan kamekaran sareng panyakit manusa. 51, 52 Dina sét data transkriptom, sababaraha RNA non-coding nunjukkeun spésifisitas tipe serat (Gambar 5A sareng Dataset Tambahan 15), kalebet LINC01405, anu spésifik pisan pikeun serat laun sareng dilaporkeun turun dina otot ti pasien anu ngagaduhan miopati mitokondria. 53 Sabalikna, RP11-255P5.3, anu saluyu sareng gén lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, nunjukkeun spésifisitas tipe serat gancang. Duanana LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) sareng RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) nunjukkeun spésifisitas otot rangka (Gambar Tambahan 9A–B) sareng teu gaduh gén kontraktil anu dipikanyaho dina lingkungan génomik 1 Mb na, nunjukkeun yén aranjeunna maénkeun peran khusus dina ngatur jinis serat tinimbang ngatur gén kontraktil tatangga. Profil éksprési spésifik jinis serat anu laun/gancang tina LINC01405 sareng RP11-255P5.3, masing-masing, dikonfirmasi nganggo RNAscope (Gambar 5B–C).
A. Transkrip RNA non-coding diatur sacara signifikan dina serat otot kedutan laun sareng gancang. B. Gambar RNAscope répréséntatif anu nunjukkeun spésifisitas jinis serat kedutan laun sareng gancang tina LINC01405 sareng RP11-255P5.3, masing-masing. Bar skala = 50 μm. C. Kuantifikasi éksprési RNA non-coding spésifik tipe miofiber sakumaha ditangtukeun ku RNAscope (n = 3 biopsi ti individu mandiri, ngabandingkeun serat otot gancang sareng laun dina unggal individu). Analisis statistik dilakukeun nganggo uji-t Student dua sisi. Plot kotak nunjukkeun median sareng kuartil kahiji sareng katilu, kalayan kumis nunjuk kana nilai minimum sareng maksimum. D. Alur kerja idéntifikasi protéin mikroba de novo (didamel nganggo BioRender.com). E. Protéin mikroba LINC01405_ORF408:17441:17358 sacara khusus diekspresikan dina serat otot rangka laun (n = 5 biopsi ti pamilon mandiri, ngabandingkeun serat otot gancang sareng laun dina unggal pamilon). Analisis statistik dilakukeun nganggo metode modél linier Limm anu digabungkeun sareng pendekatan Bayesian empiris, dituturkeun ku metode Benjamini-Hochberg pikeun sababaraha babandingan kalayan panyesuaian nilai-p. Plot kotak nunjukkeun median, kuartil kahiji sareng katilu, kalayan kumis nunjuk kana nilai maksimum/minimum.
Anyar-anyar ieu, panilitian nunjukkeun yén seueur transkrip non-coding putative ngodekeun protéin mikroba anu ditranskripsi, sababaraha di antarana ngatur fungsi otot. 44, 55 Pikeun ngaidentipikasi protéin mikroba kalayan spésifisitas tipe serat poténsial, kami milarian sét data protéin 1000 serat kami nganggo file FASTA khusus anu ngandung runtuyan transkrip non-coding (n = 305) anu kapanggih dina sét data transkriptom 1000 serat (Gambar 5D). Kami ngaidentipikasi 197 protéin mikroba tina 22 transkrip anu béda, 71 di antarana diatur sacara béda antara serat otot rangka laun sareng gancang (Gambar Tambahan 9C sareng Set Data Tambahan 16). Pikeun LINC01405, tilu produk protéin mikroba diidentifikasi, salah sahijina nunjukkeun spésifisitas serat laun anu sami sareng transkripna (Gambar 5E sareng Gambar Tambahan 9D). Ku kituna, kami ngaidentipikasi LINC01405 salaku gén anu ngodekeun protéin mikroba khusus pikeun serat otot rangka laun.
Kami ngembangkeun alur kerja anu komprehensif pikeun karakterisasi protéomik skala ageung tina serat otot individu sareng ngaidentipikasi régulator heterogenitas serat dina kaayaan séhat. Kami nerapkeun alur kerja ieu pikeun ngartos kumaha miopati nemalin mangaruhan heterogenitas serat otot rangka. Miopati nemalin nyaéta panyakit otot turunan anu nyababkeun kalemahan otot sareng, dina murangkalih anu kapangaruhan, hadir kalayan rupa-rupa komplikasi kalebet gangguan pernapasan, skoliosis, sareng mobilitas anggota awak anu terbatas. 19,20 Biasana, dina miopati nemalin, varian patogén dina gén sapertos aktin alpha 1 (ACTA1) ngahasilkeun dominasi komposisi miofiber serat anu laun-twitch, sanaos pangaruh ieu hétérogén. Hiji pengecualian anu penting nyaéta troponin T1 miopati nemalin (TNNT1), anu gaduh dominasi serat gancang. Ku kituna, pamahaman anu langkung saé ngeunaan hétérogénitas anu aya dina disregulasi serat otot rangka anu dititénan dina miopati nemalin tiasa ngabantosan pikeun ngabongkar hubungan anu rumit antara panyakit ieu sareng jinis miofiber.
Dibandingkeun sareng kontrol séhat (n=3 per grup), miofiber anu diisolasi tina pasien miopati nemalin kalayan mutasi dina gén ACTA1 sareng TNNT1 nunjukkeun atrofi atanapi distrofi miofiber anu jelas (Gambar 6A, Tabel Tambahan 3). Ieu nampilkeun tantangan téknis anu signifikan pikeun analisis protéomik kusabab jumlah bahan anu sayogi terbatas. Sanaos kitu, kami tiasa ngadeteksi 2485 protéin dina 272 miofiber rangka. Saatos nyaring sahenteuna 1000 protéin anu diukur per serat, 250 serat diuji pikeun analisis bioinformatika salajengna. Saatos nyaring, rata-rata 1573 ± 359 protéin per serat diukur (Gambar Tambahan 10A, Set Data Tambahan 17–18). Anu penting, sanaos aya panurunan anu signifikan dina ukuran serat, jerona protéom sampel pasien miopati nemalin ngan ukur rada dikirangan. Leuwih ti éta, ngolah data ieu nganggo file FASTA urang sorangan (kalebet transkrip non-coding) ngamungkinkeun urang pikeun ngaidentipikasi lima protéin mikroba dina miofiber rangka ti pasien miopati nemalin (Sét Data Tambahan 19). Rentang dinamis protéom langkung lega sacara signifikan, sareng total protéin dina grup kontrol berkorelasi saé sareng hasil analisis protéom 1000-serat sateuacana (Gambar Tambahan 10B–C).
A. Gambar mikroskopis anu nunjukkeun atrofi atanapi distrofi serat sareng dominasi jinis serat anu béda dumasar kana MYH dina miopati nemalin ACTA1 sareng TNNT1 (NM). Skala bar = 100 μm. Pikeun mastikeun réproduksibilitas pewarnaan dina pasien ACTA1 sareng TNNT1, tilu biopsi pasien diwarnaan dua dugi ka tilu kali (opat bagian per kasus) sateuacan milih gambar anu ngawakilan. B. Proporsi jinis serat dina pamilon dumasar kana MYH. C. Plot analisis komponén utama (PCA) serat otot rangka dina pasien anu ngagaduhan miopati nemalin sareng kontrol. D. Serat otot rangka ti pasien anu ngagaduhan miopati nemalin sareng kontrol diproyeksikan kana plot PCA anu ditangtukeun tina 1000 serat anu dianalisis dina Gambar 2. Salaku conto, plot gunungapi anu ngabandingkeun bédana antara pamilon anu ngagaduhan miopati nemalin ACTA1 sareng TNNT1 sareng kontrol, sareng antara pamilon anu ngagaduhan miopati nemalin ACTA1 sareng TNNT1. Bunderan warna nunjukkeun protéin anu béda sacara signifikan dina π < 0,05, sareng titik-titik poék nunjukkeun protéin anu béda sacara signifikan dina FDR < 0,05. Analisis statistik dilakukeun nganggo metode modél linier Limma sareng metode Bayesian empiris, dituturkeun ku panyesuaian nilai-p pikeun sababaraha babandingan nganggo metode Benjamini-Hochberg. H. Analisis pangayaan protéin anu diekspresikeun sacara béda sacara signifikan di sakumna protéom sareng dina serat tipe 1 sareng 2A. Analisis statistik dilakukeun nganggo paket clusterProfiler sareng nilai-p anu disaluyukeun Benjamini-Hochberg. I, J. Plot analisis komponén utama (PCA) diwarnaan ku matriks ékstrasélulér sareng istilah ontologi gén mitokondria (GO).
Kusabab miopati nemalin tiasa mangaruhan proporsi jinis miofiber anu ngébréhkeun MYH dina otot rangka,19,20 mimitina urang nalungtik jinis miofiber anu ngébréhkeun MYH dina pasien anu ngagaduhan miopati nemalin sareng kontrol. Kami nangtukeun jinis miofiber nganggo metode anu teu bias anu sateuacanna dijelaskeun pikeun uji 1000 miofiber (Gambar Tambahan 10D–E) sareng deui gagal ngaidentipikasi miofiber 2X murni (Gambar 6B). Kami niténan pangaruh hétérogén tina miopati nemalin kana jinis miofiber, sabab dua pasien anu ngagaduhan mutasi ACTA1 ngagaduhan proporsi miofiber tipe 1 anu ningkat, sedengkeun dua pasien anu ngagaduhan miopati nemalin TNNT1 ngagaduhan proporsi miofiber tipe 1 anu turun (Gambar 6B). Memang, éksprési MYH2 sareng isoform troponin gancang (TNNC2, TNNI2, sareng TNNT3) nurun dina miopati ACTA1-nemalin, sedengkeun éksprési MYH7 nurun dina miopati TNNT1-nemalin (Gambar Tambahan 11A). Ieu saluyu sareng laporan sateuacana ngeunaan switching tipe miofiber hétérogén dina miopati nemalin.19,20 Kami mastikeun hasil ieu ku imunohistokimia sareng mendakan yén pasién anu ngagaduhan miopati ACTA1-nemalin ngagaduhan dominasi miofiber tipe 1, sedengkeun pasién anu ngagaduhan miopati TNNT1-nemalin ngagaduhan pola anu sabalikna (Gambar 6A).
Dina tingkat proteom serat tunggal, serat otot rangka ti pasien miopati nemalin ACTA1 sareng TNNT1 ngahiji sareng mayoritas serat kontrol, kalayan serat miopati nemalin TNNT1 umumna anu paling parah kapangaruhan (Gambar 6C). Ieu khususna katingali nalika ngaplot plot analisis komponén utama (PCA) tina serat pseudo-inflated pikeun unggal pasien, kalayan pasien miopati nemalin TNNT1 2 sareng 3 némbongan anu paling jauh tina sampel kontrol (Gambar Tambahan 11B, Set Data Tambahan 20). Pikeun langkung ngartos kumaha serat ti pasien miopati dibandingkeun sareng serat anu séhat, kami nganggo inpormasi lengkep anu diala tina analisis proteomik 1.000 serat ti pamilon déwasa anu séhat. Kami proyéksi serat tina sét data miopati (pasien miopati nemalin ACTA1 sareng TNNT1 sareng kontrol) kana plot PCA anu diala tina analisis proteomik 1000 serat (Gambar 6D). Distribusi jinis serat MYH sapanjang PC2 dina serat kontrol sami sareng distribusi serat anu diala tina analisis protéomik 1000 serat. Nanging, kaseueuran serat dina pasien miopati nemalin ngageser ka handap PC2, tumpang tindih sareng serat kedutan gancang anu séhat, henteu paduli jinis serat MYH asli na. Janten, sanaos pasien anu ngagaduhan miopati nemalin ACTA1 nunjukkeun pergeseran ka arah serat tipe 1 nalika diukur nganggo metode berbasis MYH, duanana miopati nemalin ACTA1 sareng miopati nemalin TNNT1 mindahkeun protéom serat otot rangka ka arah serat kedutan gancang.
Teras kami ngabandingkeun sacara langsung unggal kelompok pasien sareng kontrol anu séhat sareng ngaidentipikasi 256 sareng 552 protéin anu diekspresikeun sacara béda dina miopati nemalin ACTA1 sareng TNNT1, masing-masing (Gambar 6E–G sareng Gambar Tambahan 11C, Set Data Tambahan 21). Analisis pangayaan gén ngungkabkeun panurunan anu terkoordinasi dina protéin mitokondria (Gambar 6H–I, Set Data Tambahan 22). Anu anéh, sanaos aya dominasi anu béda tina jinis serat dina miopati nemalin ACTA1 sareng TNNT1, panurunan ieu sagemblengna henteu gumantung kana jinis serat anu dumasar kana MYH (Gambar 6H sareng Gambar Tambahan 11D–I, Set Data Tambahan 23). Tilu protéin mikroba ogé diatur dina miopati nemalin ACTA1 atanapi TNNT1. Dua tina mikroprotéin ieu, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (ogé katelah LINC00598 atanapi Lnc-FOXO1) sareng ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), nunjukkeun jumlah anu béda ngan ukur dina miofiber tipe 1. ENSG00000215483_TR14_ORF67 sateuacanna parantos dilaporkeun maénkeun peran dina pangaturan siklus sél. 56 Di sisi anu sanés, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (anu saluyu sareng LINC01798) ningkat dina miofiber tipe 1 sareng tipe 2A dina miopati ACTA1-nemalin dibandingkeun sareng kontrol séhat (Gambar Tambahan 12A, Set Data Tambahan 24). Sabalikna, protéin ribosom sacara umum teu kapangaruhan ku miopati nemalin, sanaos RPS17 turun dina miopati nemalin ACTA1 (Gambar 6E).
Analisis pangayaan ogé ngungkabkeun paningkatan prosés sistem imun dina miopati nemalin ACTA1 sareng TNNT1, sedengkeun adhesi sél ogé ningkat dina miopati nemalin TNNT1 (Gambar 6H). Pangayaan faktor ékstrasélulér ieu dicerminkan ku protéin matriks ékstrasélulér anu mindahkeun PCA dina PC1 sareng PC2 dina arah négatif (nyaéta, nuju serat anu paling kapangaruhan) (Gambar 6J). Kadua kelompok pasien nunjukkeun paningkatan éksprési protéin ékstrasélulér anu kalibet dina réspon imun sareng mékanisme perbaikan sarkolema, sapertos anéksin (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 sareng protéin interaksi na S100A1159 (Gambar Tambahan 12B–C). Prosés ieu sateuacanna parantos dilaporkeun ningkat dina distrofi otot60 tapi, numutkeun pangaweruh urang, sateuacanna henteu aya hubunganana sareng miopati nemalin. Fungsi normal mesin molekuler ieu diperyogikeun pikeun perbaikan sarkolema saatos tatu sareng pikeun fusi miosit anu nembé kabentuk sareng miofiber58,61. Ku kituna, ningkatna aktivitas prosés ieu dina dua kelompok pasien nunjukkeun réspon reparatif kana tatu anu disababkeun ku ketidakstabilan miofiber.
Pangaruh tina unggal miopati nemalin berkorelasi saé (r = 0,736) sareng nunjukkeun tumpang tindih anu wajar (Gambar Tambahan 11A–B), nunjukkeun yén miopati nemalin ACTA1 sareng TNNT1 gaduh pangaruh anu sami kana protéom. Nanging, sababaraha protéin ngan ukur diatur dina miopati nemalin ACTA1 atanapi TNNT1 (Gambar Tambahan 11A sareng C). Protéin profibrotik MFAP4 mangrupikeun salah sahiji protéin anu paling ningkat dina miopati nemalin TNNT1 tapi tetep teu robih dina miopati nemalin ACTA1. SKIC8, komponén kompleks PAF1C anu tanggung jawab pikeun ngatur transkripsi gén HOX, turun dina miopati nemalin TNNT1 tapi henteu kapangaruhan dina miopati nemalin ACTA1 (Gambar Tambahan 11A). Babandingan langsung miopati nemalin ACTA1 sareng TNNT1 ngungkabkeun réduksi protéin mitokondria anu langkung ageung sareng paningkatan protéin sistem imun dina miopati nemalin TNNT1 (Gambar 6G–H sareng Gambar Tambahan 11C sareng 11H–I). Data ieu saluyu sareng atrofi/distrofi anu langkung ageung anu dititénan dina miopati nemalin TNNT1 dibandingkeun sareng miopati nemalin TNNT1 (Gambar 6A), nunjukkeun yén miopati nemalin TNNT1 ngagambarkeun bentuk panyakit anu langkung parah.
Pikeun nangtoskeun naha pangaruh miopati nemalin anu dititénan tetep aya dina sakumna tingkat otot, kami ngalaksanakeun analisis protéomik massal tina biopsi otot tina kohort anu sami tina pasien miopati nemalin TNNT1 sareng ngabandingkeunana sareng kontrol (n = 3 per grup) (Gambar Tambahan 13A, Set Data Tambahan 25). Sapertos anu dipiharep, kontrol raket patalina dina analisis komponén utama, sedengkeun pasien miopati nemalin TNNT1 nunjukkeun variabilitas antar sampel anu langkung luhur sami sareng anu katingali dina analisis serat tunggal (Gambar Tambahan 13B). Analisis massal ngahasilkeun deui protéin anu diekspresikeun sacara béda (Gambar Tambahan 13C, Set Data Tambahan 26) sareng prosés biologis (Gambar Tambahan 13D, Set Data Tambahan 27) anu disorot ku ngabandingkeun serat individu, tapi kaleungitan kamampuan pikeun ngabédakeun antara jinis serat anu béda sareng gagal pikeun ngitung pangaruh panyakit hétérogén dina serat.
Sacara gembleng, data ieu nunjukkeun yén protéomik myofiber tunggal tiasa ngajelaskeun fitur biologis klinis anu henteu tiasa dideteksi ku metode anu dituju sapertos imunoblotting. Leuwih ti éta, data ieu nyorot watesan ngagunakeun tipe serat aktin (MYH) nyalira pikeun ngajelaskeun adaptasi fenotipik. Memang, sanaos pergantian tipe serat béda antara miopati nemalin aktin sareng troponin, duanana miopati nemalin misahkeun tipe serat MYH tina métabolisme serat otot rangka nuju protéom otot anu langkung gancang sareng kirang oksidatif.
Héterogenitas sélular penting pisan pikeun jaringan pikeun minuhan paménta anu rupa-rupa. Dina otot rangka, ieu sering digambarkeun salaku jinis serat anu dicirikeun ku tingkat produksi gaya sareng kacapean anu béda. Nanging, jelas yén ieu ngan ukur ngajelaskeun sabagian leutik tina variabilitas serat otot rangka, anu langkung variabel, rumit sareng multifaset tibatan anu dipikirkeun sateuacanna. Kamajuan téknologi ayeuna parantos ngajelaskeun faktor-faktor anu ngatur serat otot rangka. Memang, data kami nunjukkeun yén serat tipe 2X panginten sanés subtipe serat otot rangka anu béda. Leuwih ti éta, kami ngaidentipikasi protéin métabolik, protéin ribosom sareng protéin anu aya hubunganana sareng sél salaku faktor penentu utama héterogenitas serat otot rangka. Ku nerapkeun alur kerja protéomik kami kana sampel pasien anu ngagaduhan miopati nematoda, kami langkung nunjukkeun yén jinis serat dumasar MYH henteu sapinuhna ngagambarkeun héterogenitas otot rangka, khususna nalika sistem kaganggu. Memang, henteu paduli jinis serat dumasar MYH, miopati nematoda nyababkeun pergeseran ka arah serat anu langkung gancang sareng kirang oksidatif.
Serat otot rangka parantos diklasifikasikeun ti saprak abad ka-19. Analisis omics anyar parantos ngamungkinkeun urang pikeun mimiti ngartos profil éksprési tina rupa-rupa jinis serat MYH sareng résponna kana rangsangan anu béda. Sakumaha anu dijelaskeun di dieu, pendekatan omics ogé gaduh kaunggulan sensitivitas anu langkung ageung pikeun ngitung spidol jinis serat tibatan metode berbasis antibodi tradisional, tanpa ngandelkeun kuantifikasi hiji (atanapi sababaraha) spidol pikeun ngajelaskeun jinis serat otot rangka. Kami nganggo alur kerja transkriptomik sareng protéomik anu saling ngalengkepan sareng ngahijikeun hasilna pikeun nalungtik régulasi transkripsi sareng pasca-transkripsi tina hétérogénitas serat dina serat otot rangka manusa. Alur kerja ieu nyababkeun kagagalan pikeun ngaidentipikasi serat tipe 2X murni dina tingkat protéin dina vastus lateralis kohort nonoman séhat kami. Ieu saluyu sareng panilitian serat tunggal sateuacana anu mendakan <1% serat 2X murni dina vastus lateralis séhat, sanaos ieu kedah dikonfirmasi dina otot sanés di hareup. Beda antara deteksi serat 2X anu ampir murni dina tingkat mRNA sareng ngan ukur serat 2A/2X campuran dina tingkat protéin matak bingung. Éksprési mRNA isoform MYH sanés sirkadian,67 nunjukkeun yén urang sigana moal "ngaleungitkeun" sinyal awal MYH2 dina serat 2X anu sigana murni dina tingkat RNA. Hiji katerangan anu mungkin, sanaos hipotétis murni, tiasa janten bédana dina stabilitas protéin sareng/atanapi mRNA antara isoform MYH. Memang, teu aya serat gancang anu 100% murni pikeun isoform MYH naon waé, sareng teu jelas naha tingkat éksprési mRNA MYH1 dina kisaran 70-90% bakal ngahasilkeun kaayaan MYH1 sareng MYH2 anu sami dina tingkat protéin. Nanging, nalika mertimbangkeun sadaya transkriptom atanapi protéom, analisis klaster tiasa sacara yakin ngaidentipikasi ngan ukur dua klaster anu béda anu ngawakilan serat otot rangka anu laun sareng gancang, henteu paduli komposisi MYH anu tepat. Ieu saluyu sareng analisis anu nganggo pendekatan transkriptomik inti tunggal, anu biasana ngaidentipikasi ngan ukur dua klaster mionukleus anu béda. 68, 69, 70 Salajengna, sanaos panilitian protéomik sateuacanna parantos ngaidentipikasi serat tipe 2X, serat ieu henteu ngagolong misah ti sésa serat gancang sareng ngan ukur nunjukkeun sajumlah alit protéin anu béda-béda dibandingkeun sareng jinis serat sanés dumasar kana MYH. 14 Hasil ieu nunjukkeun yén urang kedah uih deui ka pandangan awal abad ka-20 ngeunaan klasifikasi serat otot, anu ngabagi serat otot rangka manusa sanés kana tilu kelas anu béda dumasar kana MYH, tapi kana dua klaster dumasar kana sipat métabolik sareng kontraktilna. 63
Anu langkung penting, hétérogénitas miofiber kedah dipertimbangkeun sapanjang sababaraha diménsi. Panilitian "omics" sateuacana parantos nunjukkeun arah ieu, nunjukkeun yén serat otot rangka henteu ngabentuk gugusan anu diskrit tapi disusun sapanjang kontinum. 11, 13, 14, 64, 71 Di dieu, urang nunjukkeun yén, salian ti bédana dina sipat kontraktil sareng métabolik otot rangka, miofiber tiasa dibédakeun ku fitur anu aya hubunganana sareng interaksi sél-sél sareng mékanisme tarjamahan. Memang, urang mendakan hétérogénitas ribosom dina serat otot rangka anu nyumbang kana hétérogénitas anu henteu gumantung kana jinis serat anu laun sareng gancang. Anu jadi sabab tina hétérogénitas miofiber anu penting ieu, henteu gumantung kana jinis serat anu laun sareng gancang, tetep teu jelas, tapi éta tiasa nunjukkeun organisasi spasial khusus dina fascicles otot anu sacara optimal ngaréspon kana gaya sareng beban khusus,72 komunikasi sélular atanapi organ khusus sareng jinis sél sanés dina lingkungan mikro otot73,74,75 atanapi bédana dina aktivitas ribosom dina miofiber individu. Memang, heteroplasmi ribosom, boh ngaliwatan substitusi paralogous RPL3 sareng RPL3L atanapi dina tingkat 2′O-metilasi rRNA, parantos dipidangkeun aya hubunganana sareng hipertrofi otot rangka76,77. Aplikasi multi-omik sareng spasial digabungkeun sareng karakterisasi fungsional miofiber individu bakal langkung ningkatkeun pamahaman urang ngeunaan biologi otot dina tingkat multi-omik78.
Ku cara nganalisis protéom tina miofiber tunggal ti pasien anu ngagaduhan miopati nemalin, kami ogé nunjukkeun utilitas, efektivitas, sareng aplikasi protéomik miofiber tunggal pikeun ngajelaskeun patofisiologi klinis otot rangka. Salajengna, ku cara ngabandingkeun alur kerja kami sareng analisis protéomik global, kami tiasa nunjukkeun yén protéomik miofiber tunggal ngahasilkeun jerona inpormasi anu sami sareng protéomik jaringan global sareng manjangkeun jerona ieu ku cara ngitung heterogenitas antar serat sareng jinis miofiber. Salian ti béda anu dipiharep (sanaos variabel) dina babandingan jinis serat anu dititénan dina miopati nemalin ACTA1 sareng TNNT1 dibandingkeun sareng kontrol séhat,19 kami ogé niténan remodeling oksidatif sareng ékstrasélulér anu henteu gumantung kana switching jinis serat anu dimediasi MYH. Fibrosis sateuacanna parantos dilaporkeun dina miopati nemalin TNNT1.19 Nanging, analisis kami ngawangun kana panemuan ieu ku cara ngungkabkeun paningkatan tingkat protéin anu aya hubunganana sareng setrés anu disekresikeun sacara ékstrasélulér, sapertos anéksin, anu kalibet dina mékanisme perbaikan sarkolema, dina miofiber ti pasien anu ngagaduhan miopati nemalin ACTA1 sareng TNNT1.57,58,59 Dina kacindekanana, paningkatan tingkat anéksin dina miofiber ti pasien anu ngagaduhan miopati nemalin tiasa ngawakilan réspon sélular pikeun ngalereskeun miofiber anu atrofi parah.
Sanaos panilitian ieu ngagambarkeun analisis otot-otot-omics serat tunggal panggedéna pikeun manusa dugi ka ayeuna, éta sanés tanpa watesan. Kami ngasingkeun serat otot rangka tina sampel pamilon anu relatif alit sareng homogen sareng hiji otot (vastus lateralis). Ku alatan éta, mustahil pikeun ngaluarkeun ayana populasi serat khusus dina sadaya jinis otot sareng dina ekstrim fisiologi otot. Salaku conto, urang henteu tiasa ngaluarkeun kamungkinan subset serat ultrafast (contona, serat 2X murni) muncul dina pelari sprinter anu terlatih sareng / atanapi atlit kakuatan79 atanapi salami période teu aktip otot66,80. Salajengna, ukuran sampel pamilon anu terbatas nyegah urang nalungtik bédana jenis kelamin dina heterogenitas serat, sabab babandingan jinis serat dipikanyaho béda antara lalaki sareng awéwé. Salajengna, urang henteu tiasa ngalaksanakeun analisis transkriptomik sareng protéomik dina serat otot anu sami atanapi sampel tina pamilon anu sami. Nalika urang sareng anu sanés teras-terasan ngaoptimalkeun analisis sél tunggal sareng myofiber tunggal nganggo analisis omics pikeun ngahontal input sampel anu ultra-rendah (sakumaha anu dipidangkeun di dieu dina analisis serat ti pasien anu ngagaduhan miopati mitokondria), kasempetan pikeun ngagabungkeun pendekatan multi-omics (sareng fungsional) dina serat otot tunggal janten jelas.
Sacara umum, data kami ngaidentipikasi sareng ngajelaskeun pendorong transkripsi sareng pasca-transkripsi tina heterogenitas otot rangka. Sacara khusus, kami nampilkeun data anu nangtang dogma anu lami dina fisiologi otot rangka anu aya hubunganana sareng definisi klasik ngeunaan jinis serat dumasar MYH. Kami ngaharepkeun tiasa ngabarukeun deui debat ieu sareng pamustunganana mikirkeun deui pamahaman kami ngeunaan klasifikasi sareng heterogenitas serat otot rangka.
Opat belas pamilon Kaukasia (12 lalaki sareng 2 awéwé) sacara sukarela satuju pikeun ngiringan panilitian ieu. Panilitian ieu disatujuan ku Komite Étika Rumah Sakit Universitas Ghent (BC-10237), sasuai sareng Déklarasi Helsinki 2013, sareng kadaptar di ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Karakteristik umum pamilon dipidangkeun dina Tabel Tambahan 1. Saatos kéngingkeun idin lisan sareng tulisan, pamilon ngalaman pamariksaan médis sateuacan kalebet akhir dina panilitian. Pamilon ngora (22–42 taun), séhat (henteu aya kaayaan médis, henteu aya riwayat ngaroko), sareng rada aktip sacara fisik. Serapan oksigén maksimal ditangtukeun nganggo ergometer léngkah pikeun meunteun kabugaran fisik sapertos anu dijelaskeun sateuacanna. 81
Sampel biopsi otot dikumpulkeun nalika istirahat sareng dina kaayaan puasa tilu kali, kalayan jarak 14 dinten. Kusabab sampel ieu dikumpulkeun salaku bagian tina panilitian anu langkung ageung, pamilon ngonsumsi plasebo (laktosa), antagonis reséptor H1 (540 mg fexofenadine), atanapi antagonis reséptor H2 (40 mg famotidine) 40 menit sateuacan biopsi. Kami sateuacanna parantos nunjukkeun yén antagonis reséptor histamin ieu henteu mangaruhan kabugaran otot rangka nalika istirahat81, sareng teu aya klaster anu aya hubunganana sareng kaayaan anu dititénan dina plot kontrol kualitas kami (Gambar Tambahan 3 sareng 6). Diét standar (41,4 kkal/kg beurat awak, 5,1 g/kg karbohidrat beurat awak, 1,4 g/kg protéin beurat awak, sareng 1,6 g/kg lemak beurat awak) dijaga salami 48 jam sateuacan unggal dinten ékspérimén, sareng sarapan standar (1,5 g/kg karbohidrat beurat awak) dikonsumsi dina énjing dinten ékspérimén. Dina anestesi lokal (0,5 ml lidokain 1% tanpa epinefrin), biopsi otot dicandak tina otot vastus lateralis nganggo aspirasi Bergström perkutan.82 Sampel otot langsung dilebetkeun kana RNA engké sareng disimpen dina suhu 4°C dugi ka dibedah serat manual (dugi ka 3 dinten).
Bundelan miofiber anu nembé diisolasi dipindahkeun kana média RNAlater seger dina piring kultur. Miofiber individu teras dibedah sacara manual nganggo stereomikroskop sareng pinset anu ipis. Dua puluh lima serat dibedah tina unggal biopsi, kalayan perhatian khusus pikeun milih serat tina daérah biopsi anu béda. Saatos dibedah, unggal serat dicelupkeun sacara saksama kana 3 μl buffer lisis (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) anu ngandung énzim protéinase K sareng DNase pikeun miceun protéin sareng DNA anu teu dihoyongkeun. Lisis sél sareng panyabutan protéin/DNA teras dimimitian ku vortexing sakedap, muterkeun cairan dina mikrosentrifugasi, sareng inkubasi dina suhu kamar (10 menit). Lisat teras diinkubasi dina siklus termal (T100, Bio-Rad) dina suhu 37°C salami 5 menit, 75°C salami 5 menit, teras langsung disimpen dina suhu -80°C dugi ka diprosés salajengna.
Pustaka RNA poliadenylated anu cocog sareng Illumina disiapkeun tina 2 µl lisat miofiber nganggo QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Métode anu lengkep tiasa dipendakan dina manual produsén. Prosésna dimimitian ku sintésis cDNA untaian kahiji ku transkripsi tibalik, salami éta idéntifikasi molekuler unik (UMI) sareng barcode i1 spésifik sampel diwanohkeun pikeun mastikeun pangumpulan sampel sareng ngirangan variabilitas téknis salami pamrosésan hilir. cDNA tina 96 miofiber teras dikumpulkeun sareng dimurnikeun nganggo manik-manik magnét, saatos éta RNA dipiceun sareng sintésis untaian kadua dilaksanakeun nganggo primer acak. Pustaka dimurnikeun nganggo manik-manik magnét, tag i5/i7 spésifik kolam ditambahkeun, sareng PCR diamplifikasi. Léngkah purifikasi terakhir ngahasilkeun perpustakaan anu cocog sareng Illumina. Kualitas unggal kolam perpustakaan dipeunteun nganggo Kit Analisis DNA Fragmen Leutik Sensitivitas Tinggi (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Dumasar kana kuantifikasi Qubit, kumpulan salajengna dikumpulkeun dina konsentrasi equimolar (2 nM). Kumpulan anu dihasilkeun teras diurutkeun dina instrumen NovaSeq 6000 dina modeu standar nganggo NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nukléotida) kalayan beban 2 nM (4% PhiX).
Pipa kami dumasar kana pipa analisis data QuantSeq Pool Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Data mimitina didemultiplex nganggo bcl2fastq2 (v2.20.0) dumasar kana indéks i7/i5. Bacaan 2 teras didemultiplex nganggo idemux (v0.1.6) dumasar kana barkod sampel i1 sareng sekuen UMI diekstrak nganggo umi_tools (v1.0.1). Bacaan teras dipangkas nganggo cutadapt (v3.4) dina sababaraha babak pikeun miceun bacaan pondok (panjangna <20) atanapi bacaan anu ngan ukur diwangun ku sekuen adaptor. Bacaan teras dijajarkeun kana génom manusa nganggo STAR (v2.6.0c) sareng file BAM diindeks nganggo SAMtools (v1.11). Bacaan duplikat dihapus nganggo umi_tools (v1.0.1). Pamungkas, cacah alignment dilakukeun nganggo featureCounts dina Subread (v2.0.3). Kontrol kualitas dilaksanakeun nganggo FastQC (v0.11.9) dina sababaraha tahapan antara pipa.
Sadaya pamrosésan sareng visualisasi bioinformatika salajengna dilaksanakeun dina R (v4.2.3), utamina nganggo alur kerja Seurat (v4.4.0). 83 Ku kituna, nilai UMI individu sareng matriks metadata dirobih janten objék Seurat. Gén anu diekspresikeun dina kirang ti 30% tina sadaya serat dipiceun. Sampel kualitas handap dipiceun dumasar kana ambang minimum 1000 nilai UMI sareng 1000 gén anu dideteksi. Pamustunganana, 925 serat lulus sadaya léngkah panyaring kontrol kualitas. Nilai UMI dinormalisasi nganggo metode Seurat SCTransform v2, 84 kalebet sadaya 7418 fitur anu dideteksi, sareng bédana antara pamilon dirégrési. Sadaya metadata anu relevan tiasa dipendakan dina Dataset Tambahan 28.